小鼠AMPA离子能谷氨酸受体4(GRIA4)elisa试剂盒实验中一些常见的问题以及解决方法
问题序号可能原因解决方法显色淡,灵敏度偏低1 试剂盒未充分平衡试剂盒从2~8℃冰箱取出后打开盒盖,于室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温(约25℃)
2 样品不适合做ELISA检测样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件(例如稀释液的成分)
3 酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥防止板过于干燥
4 包被抗体遭到破坏操作温和,移液枪不能碰到孔底
5 样本和抗体孵育条件不合适按照说明书条件,建议孵育过程中全程振荡孵育。
6 洗涤浸泡时间过长按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间;
7 偶联HRP试剂污染弃去试剂,重新配置
8 错误的稀释偶联HRP试剂弃去试剂,重新配置
9 TMB底物孵育时间过短,因非人为因素影响,需要优化孵育时间确定合适的孵育时间:人为判定-浓度的标准品出现深蓝色;S4-5有淡蓝色;机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65
10 样本浓度过高或存在基质效应建议做不同稀释倍数,确认样本*合适的稀释倍数。
11 酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对确认
仪器设置及选择正确的波长检测。
12 酶标板不适合做ELISA不能使用细胞培养板,建议使用ELISA专用高吸附力板子。
背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)
1 洗涤不充分,洗后未拍干,样品中其它成分残留或酶标记物残留洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。
2 底物污染,未避光保存,出现颜色弃去底物,重新配置
3 样品稀释液污染弃去稀释液,重新配置
4 吸头重复使用,未洗净或消毒不彻底吸头尽可能一次性使用
5 不正确的孵育时间,温度(尤其是底物孵育的时间)*为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。完全按照说明书要求。
6 偶联抗体(streptavidin-HRP)浓度过高按照说明书调整到*合适的浓度
7 ELISA板子不正确的贮存酶标板贮存于2-8 ℃;使用结合力低点的Elisa板
8 没有正确封闭在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间
9 样本溶血严重建议使用非溶血或轻微溶血样本,严重溶血样本会导致背景偏高。
重复性不佳,高CV值1 样品不均一加样前充分混匀样品,取样确保移液位置一致;
2 包被板表面遭到破坏洗板加样时尽量小心,避免破坏板的包被表面
3 孔与孔之间的交叉污染孵育后取下盖子小心操作,避免孔与孔的污染;封板膜不能重复使用
4 加样量不一致样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
5 边缘效应(外周孔显色较中心孔深)孵育时尽量100 rpm旋转混匀
6 微量加样不准确保证微量加样的准确性和均一性7 不正确的洗涤洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,确定每一步的洗涤出现白板。
阳性对照不显色1 显色液变质更换新的显色液
2 洗涤液配制有误请按说明书所示稀释倍数配制
3 未加酶结合物而认为已加入注意不要漏加
4 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用每次加液前均应看清标签
5 标准品稀释方法错误/或标准品有问题请按照说明书所示配置说明书,注意单位和稀释倍数
6 不同试剂盒或不同批号的试剂混用建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
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